PCR反應(yīng)實驗步驟：

根據(jù)PCR使用說明進行試劑混合預(yù)配，并設(shè)置 PCR 循環(huán)。

簡而言之，PCR需要經(jīng)過以下循環(huán)：

1.初始化步驟。這僅對熱啟動 PCR 必不可少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。

2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并**單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環(huán)。

3.退火步驟。變性后，反應(yīng)混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補，當(dāng)反應(yīng)溫度降低到50-65℃時，引物會與模板序列匹配，互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。

4.伸長步驟。在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應(yīng)為 DNA 聚合酶的zui適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補，zui終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標(biāo) DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個堿基。

5. 2~4步稱為一個循環(huán)，每循環(huán)一次，目標(biāo)片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期，PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在 PCR 循環(huán)的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應(yīng)減慢，PCR 速率逐漸下降。

6.zui終伸長率。30-35個循環(huán)結(jié)束后，在68-74℃的溫度下zui終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。

7.貯存。zui終產(chǎn)品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10°C。